「2021年铂铑丝回收价格」，一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂钯金属中的应用
71申请人中南大学地址湖南省长沙市麓山南路932号72发明人谢建平谭玲刘新星邱冠周
74专利代理机构长沙永星专利商标事务所
普通合伙43001代理人周咏
51。。
权利要求书1页说明书6页
序列表2页附图2页
中华人民共和国国家知识产权局
发明专利申请
申请公布号
申请公布日
101/20
54发明名称
一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂回收钯金属中的应用
57摘要
本发明公开了一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂回收钯金属中的应用，表面展示金属结合蛋白基因核苷酸序列如。3所示；表面展示金属结合蛋白其氨基酸序列如。6所示；含有该基因的重组基因工程菌成功的应用于在回收工业废水的铂回收钯金属。本发明利用锚定蛋白的特性，将20基因与基因通过表达载体28+连接在一起，并导入到微生物受体中，进行重组表达；在重组表达过程中，将20表达并固定到微生物表面，从而提高微生物对铂回收钯金属的选择性和吸附性；使微生物对铂回收、钯金属离子的吸附容量分别增大1.6倍和1.3倍，对工业废水中铂回收、钯金属离子的回收率分别达到100%和97.5%。
权利要求书1/1页
1。一种表面展示金属结合蛋白基因，其特征在于，所述表面展示金属结合蛋白基因的核苷酸序列如。3所示。
2。根据权利要求1所述表面展示金属结合蛋白，其特征在于，所述表面展示金属结合蛋白的氨基酸序列如。6所示。
3。一种重组表达质粒28+--20，包含有权利要求1所述的表面展示金属结合蛋白基因的核苷酸序列。
4。根据权利要求1-3任意一项所述的含有表面展示金属结合蛋白基因的重组基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：
1人工合成。1所示的锚定蛋白基因和。2所示的金属结合蛋白基因；
2将步骤1合成序列金属结合蛋白基因和锚定蛋白基因连接在28+表达载体上，构建重组表达质粒28+--20；
3将步骤2中的重组质粒导入到大肠杆菌的受体中，通过蛋白诱导表达，并确定表达正确后，获得重组基因工程菌。
5。根据权利要求4所述的含有表面展示金属结合蛋白的重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，锚「2021年铂铑丝回收价格」定蛋白基因序列插入到28+的和酶切位点之间；金
属结合蛋白基因序列插入到28+的Ⅰ和Ⅰ酶切位点之间。
6。根据权利要求4所述的重组基因工程菌在回收铂回收钯金属中的应用。
7。根据权利要求6所述重组基因工程菌在工业废水中回收铂回收钯金属的使用方法，包括以下步骤：
1将重组基因工程菌接种到-自诱导培养基中，进行活化培养，培养完成后，离心收集工程菌菌体；
2将步骤1中的工程菌菌体加入到工业废水中进行吸附，吸附完成后，离心分离收集菌体。
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一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂回收钯金属中的应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程和贵金属回收利用领域，具体涉及一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂回收钯金属中的应用。
背景技术
[0002]铂回收族金属由于其特殊的物理化学性质，广泛的应用于各种领域，如工业、农业、医药、催化等领域。随着科技的进步，铂回收族金属的用途越来越广泛，需求量也越来越大，然而其在地壳中含量很低，我国铂回收族金属储量不到5%，在这样的形势下，从二次资源中回收铂回收族金属是有一定的社会意义与经济价值的。目前从工业废水中回收铂回收族金属方法主要为化学沉淀法、离子交换法、溶剂萃取法等，但是这些方法均难以对低浓度铂回收、钯工业废水中铂回收、钯资源进行回收。
[0003]近年来，国内外许多研究者利用微生物比表面积大、细胞表面各种基团丰富可以吸附和回收溶液中的金属离子的特点，将微生物应用于吸附工业废水中的、、、、
[0004]为提高微生物对这些金属离子的吸附性，通常会利用基因工程技术，将对金属离子有特定结合功能的蛋白基因导入到微生物中进行表达，从而提高微生物对金属离子的选择性和吸附能力；如专利.5中将一种新的金属硫蛋白基因导入到大肠杆菌受体中，获得了重组的基因工程菌，从而提高菌种对贵金属离子的吸附作用；但是这种方法获得的重组基因工程菌，蛋白的表达主要集中于微生物体内，蛋白容易被微生物胞内的蛋白酶分解，稳定性差；而且容易对「2021年铂铑丝回收价格」细胞自身氧化还原途径造成干扰，降低微生物的活性，因而这种方法表达的蛋白稳定性差，对重组基因工程菌的选择性和吸附性提升有限。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种表面展示金属结合蛋白基因及其在回收铂回收钯金属中的应用，解决了微生物对铂回收族金属选择性差、吸附性差的问题。
[0006]本发明这种表面展示金属结合蛋白基因，其核苷酸序列如。3所示。
[0007]所述表面展示金属结合蛋白其氨基酸序列如。6所示。
[0008]重组质粒28+--20含有如。3所示的基因。
[0009]所述含有表面展示金属结合蛋白基因的重组基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：
[0010]1人工合成。1所示的锚定蛋白基因和。2所示的金属结合蛋白20基因；
[0011]2将步骤1合成序列连接在28+表达载体上，得到重组质粒28+-
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-20；
[0012]3将步骤2中的重组质粒导入到大肠杆菌的受体中，通过蛋白诱导表达，并确定表达正确后，获得重组基因工程菌。
[0013]所述步骤2中，基因序列插入到28+的和酶切位点之间；20基因序列插入到28+的Ⅰ和Ⅰ酶切位点之间。
[0014]所述重组基因工程菌在回收铂回收钯金属中的应用。
[0015]所述重组基因工程菌在工业废水中回收铂回收钯金属的使用方法，包括以下步骤：
[0016]1将重组基因工程菌接种到-自诱导培养基中，进行活化培养，培养完成后，离心收集工程菌菌体；
[0017]2将步骤1中的工程菌菌体加入到工业废水中进行吸附，吸附完成后，离心分离收集菌体。
[0018]本发明的原理：
[0019]本发明将金属结合蛋白20基因和锚定蛋白基因通过表达载体28
+连接在一起，得到一种表面展示的金属结合蛋白基因，并获得重组质粒28+-20，然后将质粒导入到大肠杆菌受体中获得重组基因工程菌；重组基因工程菌对重组质粒进行表达时，锚定蛋白的端与金属结合蛋白20相连，其另一端与转膜相关结构域中的天冬氨酸残基相连，天冬氨酸残基上的糖基磷「2021年铂铑丝回收价格」脂酰肌醇通过-糖苷键与外膜蛋白的甘露糖相结合，从而将该结合蛋白固定在细胞外膜表面。
[0020]本发明的有益效果：
[0021]本发明利用锚定蛋白的特性，将20基因与基因通过表达载体28+连接在一起，并导入到微生物受体中，进行重组表达；在重组表达过程中，将20表达并固定到微生物表面，从而提高微生物对铂回收钯金属的选择性和吸附性；使微生物对铂回收、钯金属离子的吸附容量分别增大1.6倍和1.3倍，对工业废水中铂回收、钯金属离子的回收率分别达到100%和97.5%。而且该重组微生物具有容易制备、成本较低、可重复使用、无二次污染的特点，因此，对贵金属资源的回收利用具有积极的推动作用。
附图说明
1：。21原菌；2：。21工程菌；
[0023]图2实施例2中大肠杆菌对不同浓度的离子溶液的吸附效果图；[0024]图3实施例2中大肠杆菌对不同浓度的离子溶液的吸附效果图。
具体实施方式
[0025]实施例1
[0026]1蛋白和金属结合蛋白基因的合成
[0027]将锚定蛋白和金属结合蛋白20的基因序列送往生物公司进行合成和优化，使其成为适合在大肠杆菌中表达的基因序列。将合成基因序列连接在28+质粒上，其中序列插入和酶切位点之间，20序列插入Ⅰ和Ⅰ酶切位点之间，得到重组质粒28+--20，其含有如。3所示的核苷酸序列。
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[0028]2重组质粒转化。21感受态细胞
[0029]①取100μ。21感受态细胞放入离心管中，接着将离心管放入冰浴中，然后向离心管加入10μ重组质粒28+--20，轻弹混匀后，放入冰浴中静置
[0030]②将离心管置于42℃水浴中静置90，然后快速放入到冰浴中，放置时间为
3，使细胞冷却，该过程不要晃动离心管。
[0031]③向离心管中加入900μ无菌培养基，用移液枪进行反复吹吸至混匀，然后放置于37℃摇床中170振荡培养45，使菌体复苏。
[0032]④混匀离心管中内容物，然后吸取100μ已转化的感受态细胞，加入到卡那霉素抗性的固体「2021年铂铑丝回收价格」培养基上，用无菌玻璃涂棒涂布均匀，待液体被完全吸收后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养16，观察转化菌落。
[0033]3蛋白的诱导表达
[0034]①从步骤2获得的转化菌落中挑取转化单菌落，并置于10液体培养基中，放置于37℃摇床中170振荡培养6。
[0035]②吸取上述培养液100μ接种于10液体培养基中，并加入50μ10/的卡那霉素溶液，放置于37℃摇床中170振荡培养。
[0036]③取培养中的菌液，用分光光度计在600波长处测量其吸光度，当0.5时，将培养液从摇床中取出，冷却。
[0037]④加入10020μ，混匀后放置于16℃摇床170振荡培养16，获得重组菌菌液。
[0038]4蛋白质电泳
[0039]①收集菌体：取。21原菌液和步骤3获得的重组菌菌液1.5，10000离心3，弃去上清液。用0.01缓冲液洗涤2次，10000离心3，然后用3缓冲液重新悬浮。
[0040]②细胞破碎：将装有菌液的离心管置于冰浴中，240，4秒/次，破碎60次，时间间隔为7秒。菌液变澄清后取出，若未变澄清，可适当增加超声波处理次数。
[0042]④将蛋白质10μ和煮沸的样品20μ用移液枪加入蛋白胶的各泳道中，
100，电泳90。
[0043]⑤实验观察：将凝胶放置于-250蛋白染色剂中，煮沸3，倒掉染色剂，加入去离子水煮沸5，然后倒掉废液，再加入去离子水，重复三次，将凝胶放置于凝胶成像系统中观察蛋白是否表达成功。
[0044]本实施例中。21重组菌的蛋白质电泳图如图1所示，由图1可知：。21重组菌与。21原菌相比，在25-35之间明显多存在一条蛋白条带，说明本发明的表面展示金属结合蛋白基因表达成功，获得了。21重组菌。
[0045]重组工程菌表达的表面展示的金属结合蛋白氨基酸序列如。6所示金属结合蛋白氨基酸序列如。5所示，锚定蛋白的氨基酸序列如。4，锚定蛋白的氨基酸序列为。6序列表中的1-180，金属结合蛋白的氨基酸序列为4/6页。6序列表中的187「2021年铂铑丝回收价格」-226。重组基因工程菌进行对重组质粒进行表达时，锚定蛋白的端与金属结合蛋白20相连，另一端与转膜相关结构域中的天冬氨酸残基相连，天冬氨酸残基通过糖基磷脂酰肌醇的-糖苷键的方式与外膜蛋白的甘露糖相结合，从而将该结合蛋白固定在细胞外膜表面。
[0046]实施例2
[0047]本实施例中，采用的钯金属溶液，浓度为0.5、2.5、5、25、50、100、200/，吸附为3.0。海绵铂回收程辉贵金属实验具体操作步骤如下结合图1：
[0048]1微生物吸附剂的制备，具体步骤为：
[0049]将。21原菌接种到已灭菌的培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。将实施例1制备的。21工程菌接种到-自诱导培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。其中自诱导培养基购
自青岛高科园海博生物技术有限公司，1培养基中含有培养粉27.5，甘油5。
[0050]2储备液的制备，具体步骤为：
[0051]将0.8342溶于500去离子水中，加入一定量浓调节溶液到1.0，随后放置在80℃-7型恒温水浴锅中于170条件下搅拌1至完全溶解，冷却后用容量瓶定容至1，即获得500/储备液，使用时用容量瓶稀释至所需浓度。
[0052]3生物吸附实验，具体步骤为：
[0053]配制3.0，浓度为0.5、2.5、5、25、50、100、200/的金属溶液，按照终浓度为5/添加。21原菌或者重组基因工程菌。二者充分混匀后，30℃、170吸附3，然后10000离心5，原子吸收法测定上清液中残留的浓度。
[0054]实验结果如图2所示，经改造后。21对钯离子的吸附能力明显高，吸附量由109.334/提高到143.768/，提高到约1.3倍。整个吸附过程十分迅速，在30内吸附量达到总吸附量的90%以上。因此，此基因改造能浙江铂碳回收哪家好有效提高。21对钯离子的吸附能力，吸附时间短，具有巨大的工业应用潜力。
[0055]实施例3
[0056]本实施例中，采用的铂回收金属溶液，浓度为1、5、10、50、100、200/，吸附为
3.0。实验具体操作步骤如下：
[0057]1微生物吸附剂的制备，具体步骤为：
[0058]将。21原菌接种到已灭菌的培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。将实施例1制备。21工程菌接种到-自诱导培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。其中自诱导培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，1培养基中含有培养粉27.5，甘油5。
[0059]2储备液的制备，具体步骤为：
[0060]将0.8642溶于500去离子水中，170震荡1至完全溶解，用容量瓶定容至1，即获得500/储备液，使用时用容量瓶稀释至所需浓度。
[0061]3生物吸附实验，具体步骤为：
[0062]配制3.0，浓度为1、5、10、50、100、200/的金属溶液，按照终浓度为
5/添加。21原菌或者工程菌。二者充分混匀后，30℃、170吸附3，然后
10000离心5，原子吸收法测定上清液中残留的浓度。
5/6页[0063]实验结果如图3所示，。21对铂回收离子的吸附量仅为69.630/，经过基因改造后，。21工程菌对铂回收离子的吸附量达到112.669/，为前者的1.6倍。另外，此吸附过程耗时较短，在90时基本达到平衡。因此，本工程菌能够用于吸附回收溶液中的铂回收离子，具有工业化应用潜力。
[0064]实施例4
[0065]本实施例中采用工业废水溶液，实验具体操作步骤如下：
[0066]1微生物吸附剂的制备，具体步骤为：
[0067]将。21原菌接种到已灭菌的培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。将实施例1制备的。21工程菌接种到-自诱导培养基中，30℃、170培养24，然后10000离心10，收集菌体。其中自诱导培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，1培养基中含有培养粉27.5，甘油5。
[0068]2生物吸附实验，具体步骤为：
[0069]在工业废水原溶液中加入5/的。21原菌或者工程菌，二者充分混匀后，
30℃、170吸附3，然后10000离心5，原子吸收法分析上清液中的全元素。同时，分析未吸附前工业废水中的全元素种类及含量。
[0070]实验结果如表1所示，其中工业废水原液中总共含有19种元素，其中含量最高的分别为、、，浓度分别达到10350、1095.5和133.2/。另外，工业废水中的、离子含量也较高，浓度苏州铂碳回收公司为28.76和23.95/。贵金属、和浓度达到24.51、3.21和5.84/，极具有回收价值。结果表明，。21原菌和工程菌对废水中的和具有很强的选择性吸附，吸附3后，和工程菌的吸附废水上清液中浓度只有2.99和0.627/吸附率达到88.2%和97.5%。于而言，。21原菌吸附后溶液中残留金属浓度为0.218/，而改造后的。21能将工业废水中的金属完全吸附，吸附率达到100%。尽管工业废水中和离子浓度很高，但实验结果表明，。21原菌和工程菌对二者的吸附很少，同时，对其它金属离子的吸附也较少，这说明菌种对工业废水中的和离子具有选择性吸附，可以用于回收工业废水中的和贵金属。
[0071]表1。21原菌和工程菌对工业废水的吸附
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